测序发现引物区有突变，主要考虑三个方面的原因：测序，PCR/克隆过程，引物本身。

1、测序引入的错误

对于PCR产物进行的克隆而言，无论是TA克隆或酶切克隆，引物区往往位于载体两端，如果用载体引物进行测序，此时克隆引物区离测序引物区的距离比较近，处于测序起始阶段或正好处于测序染料峰所在的区域内（90-120 bp），这两个区域也是最容易产生测序错误的地方。因此，首先要看原始的测序峰图在引物区内是否清晰，碱基的错误或缺失是否是由于峰图不清楚而导致的计算机误读。

2、PCR/克隆过程

尽管使用高保真聚合酶进行PCR出错的可能性比较少，但不排除PCR错配或者克隆过程中突变的可能。有的人会问，PCR的突变怎么会出现在引物区呢？这是因为，引物是单链，PCR产物引物区的互补链同样是以引物为模板进行扩增得到的，因此，有可能存在引物正确但其产物出错的情况。

针对这种情况的解决方法是进行测序时，请送2-3个独立的克隆子进行测序，这样可以排除PCR过程出错或克隆产生突变的情况。

3、引物本身错误

如前面所述，引物合成是一种多步骤的化学反应，即使每一步合成效率达到99%，仍有1%的序列不能连接或错误地连接下一个碱基，这些序列在经过Capping后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；

对于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不*造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于实验中测序发现的较常见碱基缺失的可能原因如下：

1)、 由于DNA合成是沿着3'→5'端方向将碱基逐个连接上去的，每连上一 个碱基，都需要经过 (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)一个循环。Coupling是上一个碱基的5'-OH 与下一个碱基的3'活性部分发生反应，该反应的效率可达99%，即便如此，仍有1%的序列不能连接下一个碱基，这些序列在经过Capping后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；

2）、 Capping是将没有连接上下一个碱基的5'-OH乙酰化，Capping的效率不可能达到100%，没有被乙酰化的5'OH会进一步发生反应，造成中间缺碱基的失败序列；

3）、 Detritylation是脱掉上一个碱基5'-OH上的保护基，准备连接下一个新碱基，Detritylation的效率也不可能达到100%，没有脱保护的5'-OH会跳过该循环而直接进入下一个循环，造成中间缺碱基的失败序列；

至于插入突变，引物序列中往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分碱基发生丢失DMT，处于活性状态的新碱基在没有与上一个碱基反应前发生自连，将会造成碱基重复，故会发生插入同一碱基的突变的失败序列。

对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，通常发生在G转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体2,6-diaminopurine（脱嘌呤），DNA复制和PCR过程中DNA聚合酶将2,6-diaminopurine看作碱基A，发生G到A的转换，测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。

引物合成过程中，造成碱基缺失，插入，置换突变的因素客观存在，上述各种原因产生的失败序列可通过纯化不同程度地得到去除。但是基于目前大规模生产的纯化方法，还不能达到100%的纯度，对40 mer以下的DNA制品，HPLC是好的纯化方法，其次是ULTRA PAGE；而对40 mer以上的DNA制品ULTRAPAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。所以，如您要对PCR产物克隆后测序，一定要选择ULTRA PAGE纯化或HPLC纯化的引物。

测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是偶尔也会发生。客户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列复制到合成仪的，人为造成的序列出错可能微乎其微。在目前的技术水平下，各家公司还没有办法*解决引物合成出错的这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所以每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有哪家公司可以*避免。