ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述ELISA常见问题与解决方法：

1. 阴性对照出现阳性结果

①  样品、试剂被污染，或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现交叉污染——更换试剂，小心操作。

② 酶标板洗涤不*——洗板前先将抗体溶液倒干净，然后清洗液倒满板孔，确保能充分洗涤。

③ 抗体量过多导致非特异性结合——根据说明书的推荐量使用抗体，稀释抗体到适当浓度。

2．酶标板整体背景高

① 抗体非特异性结合——应确保板孔进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液以防止非特异性结合。

② 底物结合浓度过高——对底物进行适当稀释。

③ 反应时间过长——当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应，适当缩短显色时间。

④ 底物溶液污染——正常底物溶液应是澄清透明的，若出现黄色或其他颜色表明受到污染，应更换新的底物溶液。

⑤ 底物孵育过程没有避光——底物孵育应在避光条件下进行。

3. 复孔之间重复性差

① 样品数量不整齐，加样时间有长有短——加重复孔时尽量保持加样时间与第一次接近。

② 加样量不一致——样品稀释前应充分混匀，并且使用同一移液枪。

③ 洗涤条件、操作人员不一致——重复测定样品时，操作条件、人员应尽可能与上次保持一致。

4. 吸光值偏高或偏低

① 样品中待测抗原含量太低会导致测定结果偏低——可尝试增加样品使用量。

② 加入抗体量不合适会造成结果偏低或偏高——使用建议抗体量或为了使结果更好尽可能调整抗体的适用量。

③ 孵育时间太短导致检测结果偏低——适当延长抗体或抗原的孵育时间，确保待测样品与检测抗体能充分结合。

④ 孵育温度不适合——应保证抗体在最适宜条件下进行孵育（一般37℃孵育1h）。