不同的实验方法需要不同的抗体特性，因为抗原以不同的方式呈现。在变性SDS-PAGE 后，抗原可能是蛋白质印迹检测中呈线性的氨基酸序列，或者在细胞免疫分离、免疫沉淀或基于 ELISA 的方法中整体是天然结构。在免疫染色中，必须检测固定细胞或组织中的交联、化学修饰结构。这意味着一种抗体可能在一种应用中表现出优异的性能，但在另一种应用中却不适用。这也意味着一种检测的特异性并不能保证在不同应用中的特异性。必须对所有应用程序独立进行验证。下面详述下抗体验证的八种方法：

1. 省略一抗

这是测试由二级试剂引起的潜在背景的有用且重要的控制。然而，这个实验没有提供关于一抗质量的信息。

2.抗体信号与文献数据一致

WB 中观察到的分子量、组织分布和染色模式与文献一致。这种验证方法很容易执行，但也有一些限制；例如，WB 中条带的正确分子量并不一定会告诉您该条带是所需的目标蛋白质。在 WB 中很容易有数百种蛋白质以相同的速度运行，这可能会导致对结果的误解。文献中的数据也可能不正确或不完整。

3. 转染细胞以过表达靶抗原

在表现出弱内源性表达或无内源性表达的细胞系中，过表达靶蛋白可以给出抗体特异性和敏感性的问题。通过这种方法可以很容易地评估与同一蛋白质的不同亚型的反应性。然而，人为的高水平靶蛋白通常不能反映内源性表达水平。组织或细胞裂解物中预期大小或定位的干净信号，已知含有目的蛋白质，结合过表达系统中的阳性结果，是特异性的良好指标。

4.用免疫原阻断/预吸附抗体

特别是对于多克隆血清，这是确定观察到的信号是否与免疫抗原相关的有用实验。如果信号在预吸附后消失，则该信号很有可能是特异性的。然而，不能排除与共享类似抗体结合表位的其他蛋白质发生交叉反应的可能性（可在此处找到建议的预吸附方案）。

5.KO细胞或组织

KO(Knock-out)敲除测试抗体特异性的金标准。与野生型相比，KO中的信号丢失是特异性的zui可靠证据。请记住，在蛋白质印迹中成功的KO验证并不能保证在其他应用（如免疫染色）中的特异性。不幸的是，KO细胞或组织并不总是可用的。

6.KD-细胞或组织

KD(Knock-down)目标的敲低也可以告诉您很多关于抗体特异性的信息。与KO相比，通过 RNAi下调蛋白质通常更快、更容易完成。根据降低的mRNA水平，与对照系统相比，KD模型中的信号或染色应减少。有时KD不是很有效，结果的解释可能很困难。

7.IP或ELISA应用的IP/MS验证

免疫沉淀 (IP)以及随后通过质谱(MS)进行的蛋白质鉴定是分析IP或ELISA应用的抗体特异性的强大工具。然而，这种方法并没有告诉您很多关于其他应用（如蛋白质印迹或免疫染色）中抗体特异性的信息。

8.针对同一目标不同表位的抗体

这种验证方法可以提供有关抗体特异性的宝贵数据，尤其是在免疫染色或蛋白质印迹应用中。用针对同一目标但具有不同表位的抗体获得的匹配染色模式为其特异性提供了很好的证据。结合靶蛋白不同部分的不同抗体不太可能具有相同的非特异性结合配偶体。

总结：

如果你有 KO 模型，则抗体的验证非常简单明了。如果这个黄金标准不可用，则必须收集尽可能多的关于目标和抗体本身的信息和验证数据，以产生高概率的特异性。