细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。适度的保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丟种，起到细胞保种的作用。

贴壁细胞冻存操作步骤：

1. 制备冻存液，冻存液比例：实验室采用90% FBS+10% DMSO；

2. 取形态良好，处于对数生长期的细胞，吸出旧培养基，加PBS冲洗一次；

3. yi酶消化细胞，镜下观察细胞，待细胞全变圆后，加全培养基终止消化，800g离心5min收集细胞；

4. 弃去离心管上清液，加入冻存液重悬细胞，小心打开冻存管管盖，每管分装1-1.5mL含细胞的冻存液，拧紧盖管，做好标记；

5. 分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放-80℃过夜；

6. 若没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：

室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化；

7. 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。

注意事项：

1. 必须始终穿戴适当的个人防护设备，手套污染时应当更换，将用过的手套与其他污染的实验室废物一起处置。

2. 实验前和实验后需要灭菌处理，实验前，实验台打开紫外灯照射20-30分钟，实验后需要用75%酒精擦拭超净台、边台、倒置镜的载物台。

3. 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、 yi蛋白酶的瓶子均要75％酒精擦拭瓶子的外表面，靠近酒精灯火焰操作。

4. 冻存时细胞浓度低于1-5×106个/ml。

5. 冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤。

6. 冻存细胞长期保存应放置于液氮，不建议在-80℃长期保存。

7. 细胞离心后尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液。

8. DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，冷却后再使用，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。