Taq酶活性的定义是基于其在特定条件下的催化能力,通常用单位酶活来表示。Taq酶活性检测方法主要包括以下几种技术手段:
一、生物发光技术:
1、通过检测PCR反应中产生的焦磷酸(PPi)间接测定酶活性。具体步骤包括:
2、利用ATP硫酰化酶将PPi转化为ATP。
3、通过虫荧光素酶系统发光检测ATP量。
4、绘制焦磷酸标准曲线计算酶活性。
二、荧光定量PCR:
利用扩增产物的荧光信号强度动态监测活性。
三、绝对活性测定法:
通过dATP消耗量直接计算活性,适用于精准定量。
四、功能标记检测:
针对特定应用场景的检测:
使用基因型与表型方差分析评估等位变异类型。
通过POD活性等指标量化酶功能表现。
五、dNTP掺入法:
标准活性定义方法:
1个酶单位(U)定义为在74℃下,30分钟内催化10 nmol dNTP掺入酸不溶物所需的酶量
通过测定dNTP消耗量或DNA合成量计算活性。
六、质量控制检测:
包括:
1、核酸内切酶活性检测(质粒DNA完整性)。
2、非特异性核酸酶活性检测。
3、宿主DNA残留检测(qPCR法)。
不同检测方法各有优劣,生物发光法灵敏度高但操作复杂,dNTP掺入法简便但特异性较低,实际应用中需根据检测目的选择合适方法。