1、选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天*换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% yi 蛋白酶消化。适时去掉yi蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心（1000r/min，10分钟）。

2、去上清液，加入含20%小牛血清的*培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。

3、将上述细胞分装于安瓿或冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要*封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。

4、将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，蕞后沉入液氮中。

细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，*取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。