ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。下面来详述解说ELISA显色底物的区别：

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:

　　　　　　　　　　　　　　　HRP

　　　　　　　　　DH2＋H2O2────→D＋2H2O

　　供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。

1、DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。

2、5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。

3、OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。

4、目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。

5、另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体