第二抗体是指能和抗体结合,即抗体的抗体,其主要作用是检测抗体的存在,放大一抗的信号。二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质,去免疫异种动物,由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。二抗针对某一特定物种(如小鼠)的所有抗体(如IgG、IgM或IgA等)均具有反应性。以下列举二抗的原理及特点:
1、SABC法
原理:SABC法是利用链酶亲和素(Streptavidin)与生物su(Biotin)*的高度亲和力这一生物学性质,先将生物su与辣根过氧化物酶(HRP)结合,形成生物su化HRP,然后与链酶亲和素按一定比例混合,形成SABC复合物。用生物su化二抗与第一抗体结合,再与SABC复合物联结形成抗原~抗体~生物su化二抗~ SABC复合物。最后用底物显色剂显色。
特点:该法具有灵敏度高以及低背景染色等特点。
2、SP法
原理:根据生物su(Biotin) 与链霉亲和素(Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在一抗(兔源与鼠源)与相应的靶抗原结合后,生物su化标记的抗多价二抗与一抗特异结合;二抗上标记的生物su与标记了辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素结合,形成抗原~特异性一抗~生物su化的二抗~HRP 标记的链霉亲和素复合物。
特点:该法孵育时间短(通常为10min),灵敏度高以及低背景染色等特点。
3. Polymer酶标二抗法
原理:该法采用一段多聚氨基酸聚合物做为载体链,将该多聚物与二抗结合,然后可再标记上多个HRP/AP酶分子,所以同样具有很高的信号放大作用。
特点:灵敏度高;操作步骤简单;无需进行内源性的生su封闭。
4. 直接酶标二抗法
该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单,成本低,但是因为没有信号放大作用,所以对很多表达丰度不是很高的抗原就可能检测不到。