第二抗体是指能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体（如IgG、IgM或IgA等）均具有反应性。以下列举二抗的原理及特点：

1、SABC法

  原理：SABC法是利用链酶亲和素(Streptavidin)与生物su(Biotin)*的高度亲和力这一生物学性质，先将生物su与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物su化HRP，然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成SABC复合物。用生物su化二抗与第一抗体结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗体～生物su化二抗～ SABC复合物。最后用底物显色剂显色。

  特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色等特点。

2、SP法

  原理：根据生物su(Biotin) 与链霉亲和素(Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在一抗（兔源与鼠源）与相应的靶抗原结合后，生物su化标记的抗多价二抗与一抗特异结合；二抗上标记的生物su与标记了辣根过氧化物酶（HRP）的链霉亲和素结合，形成抗原～特异性一抗～生物su化的二抗～HRP 标记的链霉亲和素复合物。

  特点：该法孵育时间短（通常为10min），灵敏度高以及低背景染色等特点。

3. Polymer酶标二抗法

  原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可再标记上多个HRP/AP酶分子，所以同样具有很高的信号放大作用。

  特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需进行内源性的生su封闭。

4. 直接酶标二抗法

  该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单，成本低，但是因为没有信号放大作用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就可能检测不到。