内毒素ELISA检测试剂盒是一种用于体外定量检测生物样本中内毒素（ET）浓度的工具，在科研和医学诊断领域应用广泛。该试剂盒多基于双抗体夹心法或竞争酶联免疫吸附试验技术。以双抗体夹心法为例，用纯化的内毒素抗体包被微孔板制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入内毒素，再与HRP标记的内毒素抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻d洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内毒素呈正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中内毒素浓度。

　　内毒素ELISA检测试剂盒的操作流程要点：

　　（1）加样规范

　　样本处理：

　　血清/血浆需离心（≥3000 rpm，10分钟）去除杂质，稀释倍数参考说明书。

　　避免反复冻融样本，建议单次实验分装使用。

　　加样顺序：

　　标准品：按浓度从低到高依次加样，每孔100μL（具体体积以说明书为准）。

　　样本：单孔或双孔重复，设置阴性/阳性对照（如厂家提供）。

　　空白对照：加入稀释液替代样本。

　　加样技巧：

　　紧贴孔壁加样，避免滴入孔底产生气泡。

　　加样后轻摇板架混匀，但避免剧烈晃动。

　　（2）孵育与洗涤

　　孵育条件：

　　37℃恒温箱孵育（时间通常30-60分钟），避免温度波动。

　　若室温过低，需延长孵育时间或使用加热板。

　　洗板操作：

　　弃去孔内液体，每孔注入300-400μL洗液，静置5秒后拍干（避免用力过猛导致微球脱落）。

　　重复洗板5次，最后在吸水纸上扣干残留液。

　　（3）显色与终止

　　显色底物：

　　TMB（四甲基联苯胺）需避光保存，临用前等体积混合A液和B液（如H₂O₂）。

　　每孔加100μL，室温避光反应（通常10-15分钟），观察颜色变化。

　　终止反应：

　　及时加入终止液（如2M H₂SO₄），每孔50μL，轻敲板框混匀。

　　终止后立即检测OD值（延迟可能导致读数偏差）。