PCR检测是一种基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）技术的分子生物学检测方法，主要用于扩增和检测特定DNA或RNA序列。

一、PCR检测的基本原理

1、DNA扩增技术：PCR通过模拟DNA自然复制过程，在体外对特定DNA片段进行指数级扩增。核心步骤包括：

变性：高温（93℃）使双链DNA解离为单链。

退火：降温（58℃）使引物与单链DNA结合。

延伸：DNA聚合酶在72℃催化下合成新链。

2、循环重复：上述步骤循环30-35次，目标DNA片段数量呈指数增长（2^n倍），实现微量样本的可检测性。

二、PCR检测的标准操作流程

1、反应体系配置：

l 在无菌离心管中混合：10×PCR缓冲液（5μl）、dNTP混合液（4μl）、引物1和引物2（各2μl）、Taq酶（1μl）、DNA模板（1μl）、无核酸酶水补足至50μl。

l 若PCR仪无热盖，需添加石蜡油防止蒸发。

2、扩增程序：

l 预变性：93℃加热3-5分钟。

l 循环阶段：93℃变性40秒 → 58℃退火30秒 → 72℃延伸60秒，重复30-35次。

l 最终延伸：72℃保温7分钟。

3、结果处理：

l 产物置于4℃短期保存或-20℃长期保存。

l 电泳检测：若含石蜡油需用氯仿抽提去除，取5-10μl样本进行凝胶电泳。

三、特殊场景注意事项

1、菌液PCR操作

l 直接使用热解菌液（10μL LB培养基重悬单菌落）作为模板。

l 加样需在超净台内完成，避免杂菌污染。

2、高GC含量模板扩增

l 增加DMSO至5-10%（v/v）降低二级结构，使用热启动酶（如HotStart Taq）。

l 提高预变性温度至98℃，延长变性时间至10分钟。

PCR检测作为分子诊断核心工具，其技术迭代与规范化应用将持续深化在传染病防控、肿瘤诊疗及宠物健康等领域的价值，但需警惕技术滥用与数据安全风险。